07月03 【成功案例】通過轉(zhuǎn)錄組研究合浦珠母貝異種異體移植大珠母貝的免疫抑制反應(yīng)

Transcriptome analysis of the immune reaction of the pearl oyster Pinctada fucata to ?xenograft from Pinctada maxima

1. 1. 研究背景

   大珠母貝（P. maxima）通過同種異體移植的方法進(jìn)行培養(yǎng)面臨很大的困難，而對于合浦珠母貝（P. fucata）而言，同種異體移植培養(yǎng)較容易實(shí)現(xiàn)。如果合浦珠母貝可以作為孕育受體去培養(yǎng)大珠母貝珍珠，將有益于大珍珠培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。移植后的免疫抑制反應(yīng)是阻礙該產(chǎn)業(yè)前行的一大障礙。據(jù)前期的研究統(tǒng)計(jì)，珠母貝通過異種異體移植的存活率約在6.3%-15.4%之間。人體器官異種異體移植的免疫反應(yīng)已有相關(guān)報(bào)道；在軟體動(dòng)物中，異種異體移植的免疫抑制反應(yīng)也有報(bào)道；但是在珠母貝免疫反應(yīng)研究中，僅有一項(xiàng)通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對珠母貝同種異體移植免疫抑制反應(yīng)的研究。

   2. 研究目的

   此項(xiàng)研究希望通過轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對合浦珠母貝異種異體移植后免疫分子變化進(jìn)行探索，尋找對抗宿主珠母貝免疫抑制反應(yīng)的策略。

   3. 材料方法

   ?3.1實(shí)驗(yàn)材料

   大珠母貝，合浦珠母貝

   實(shí)驗(yàn)組：

   同種組：合浦珠母貝植入合浦珠母貝地幔片

   異種組：合浦珠母貝植入大珠母貝地幔片

   對照組：合浦珠母貝

   實(shí)驗(yàn)組分別取手術(shù)后不同時(shí)期的宿主珠母貝（0 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h和?96 h）血淋巴，?Control組收集宿主珠母貝的血淋巴（0h），共15個(gè)樣本，分別進(jìn)行RNA提取。

   ?3.2測序方法和數(shù)據(jù)量

   測序平臺：Illumina Hiseq?2500 platform

   總計(jì)得到107.93Gb的clean reads，平均每個(gè)樣本7.1Gb的數(shù)據(jù)。

   3.3分析方法

   所有分析在百邁客云平臺完成（BMK Cloud?：http://cigarsoftampa.com/）。

   主要分析：

   a．?dāng)?shù)據(jù)質(zhì)控 （去接頭，去低質(zhì)量的序列）；

   b．利用合浦珠母貝參考基因組進(jìn)行組裝；

   c．與數(shù)據(jù)庫比對（NR、Swiss-Prot 、GO 、COG 、KOG 、Pfam 和KEGG）注釋；

   d．差異表達(dá)基因分析（GO分析、KEGG通路富集）。

   4.技術(shù)路線

5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

分別對14個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對照組樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，測序數(shù)值如表1所示，每個(gè)樣本的Q30都在91.42%以上，GC含量在42.19%和45.38之間。

5.2?差異表達(dá)基因分類和功能注釋

分別將各個(gè)時(shí)期（0h、6h、12h、24h、48h、72h、和96h）同種異體移植組（M組）和異種異體移植組（B組）基因表達(dá)量進(jìn)行比對，獲得各個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)基因，在0h，獲得的差異表達(dá)基因最多，共2265個(gè)，其中1097個(gè)上調(diào)，1168個(gè)下調(diào)（FDR﹤0.05，log2 ratio ≥1）。

圖1.不同時(shí)期差異表達(dá)基因

將每個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類，獲得45-49個(gè)子分類，根據(jù)GO的三大功能類別(cellular component,molecular function和biological process)分析，大多數(shù)免疫相關(guān)的基因被富集到biological process這一類。

通過KEGG通路富集分析，各個(gè)時(shí)期的差異表達(dá)基因分別富集到148（M0/BO），106（M6/B6），99（M12/B12），92（M24/B24），73（M48/B48），123（M72/B72），和96（M96/B96）個(gè)通路中。

5.3異種異體移植引起的免疫相關(guān)差異表達(dá)基因

為了鑒定這些差異表達(dá)基因參與的免疫路徑，探索異種異體移植引起的基因表達(dá)具體變化，研究人員通過GO富集將各時(shí)期的同種移植和異種移植免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因分成不同的功能類別（P≤0.05），在M0/B0組中，細(xì)胞循環(huán)，NADH脫氫酶活性等相關(guān)基因顯著富集，其中一些與免疫學(xué)過程相關(guān)；在M12/B12組中，有大量的氧化還原過程和調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)移的unigenes，它們可能參與血球細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和吞噬；通過數(shù)據(jù)分析得到，48h和72h中，損傷修復(fù)是重要的term，它與免疫反應(yīng)最相關(guān)；在96h，細(xì)胞凋亡是重要的term。

結(jié)合KEGG通路富集分析，在M0/B0的比對中發(fā)現(xiàn)，核糖體，氧化磷酸化和GPI錨等相關(guān)路徑被顯著富集。在M6/B6比對中，有9個(gè)顯著富集的通路，包括細(xì)胞凋亡、拼接體和MAPK信號通路等，且大多數(shù)通路與免疫功能相關(guān)；值得注意的是MAPK信號通路在6h、24h、72h和96h組多次出現(xiàn)并且顯著富集。MAPK信號通路和其他免疫相關(guān)通路富集，可能是該研究中描述同種異體移植和異種異體移植免疫反應(yīng)差異的一個(gè)好起點(diǎn)。

圖2.不同時(shí)期差異表達(dá)基因GO富集圖

通過unigene聚類分析鑒定了不同時(shí)間點(diǎn)的免疫相關(guān)基因：在0h，參與氧化還原反應(yīng)的基因（包括NADH脫氫酶1、細(xì)胞色素c氧化酶1等）在異種異體移植中上調(diào)；在6h，熱休克蛋白70、熱休克70kDa蛋白等在異種異體移植中比同種異種中表達(dá)量高；在12h，NADH脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在異種移植中高表達(dá)；

研究人員通過GOterm分析檢測到參與氧化還原反應(yīng)的表達(dá)基因，在24h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植中大量表達(dá)；在48h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和熱休克蛋白70在異種異體移植中大量表達(dá)；在72h，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶 pak-1在異種異體移植組中表現(xiàn)出下調(diào)；96h，熱休克蛋白70和TNF受體關(guān)聯(lián)因子6繼續(xù)在異種異體移植中高表達(dá)，表明免疫反應(yīng)依然存在。

圖3.不同時(shí)期unigene聚類熱圖

5.4移植引起的差異表達(dá)基因鑒定

將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別與對照組進(jìn)行比對后，再將比對后的同種異體移植與異種異體移植進(jìn)行比對。獲得不同時(shí)期（ 0h/6h/12h/24h/48/72h/96h）的差異表達(dá)基因分別為518，814，807，710，689，700，832個(gè)。

圖4.兩實(shí)驗(yàn)組與對照組比對韋恩圖

通過KEGG通路富集分析，河馬信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、 MAPK信號通路、核糖體等通路顯著富集。許多基因在實(shí)驗(yàn)組高表達(dá)，在對照組表達(dá)量較低，細(xì)胞異常死亡蛋白1和蛋白激酶7在對照組中表達(dá)量較高，但是在實(shí)驗(yàn)組中幾乎不表達(dá)，說明這些差異表達(dá)基因是由移植引起 。

6.RT-PCR驗(yàn)證

從不同表達(dá)水平中隨機(jī)選擇10個(gè)與免疫相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果基本一致，證明了本實(shí)驗(yàn)中的差異基因表達(dá)譜準(zhǔn)確可靠。

圖5.RT-PCR驗(yàn)證

7.結(jié)論

綜上所述，無論在同種移植還是異種移植，免疫抑制都是重要的免疫反應(yīng)。細(xì)胞凋亡、河馬信號通路、氧化還原作用、MAPK信號通路、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、嘌呤新陳代謝、NF-kappa B 信號通路、氧化磷酸化、Ras 信號通路、泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解參與了移植應(yīng)答反應(yīng)。NADH脫氫酶、HSP70、細(xì)胞凋亡蛋白酶-7分別在氧化還原反應(yīng)，MAPK信號通路和細(xì)胞凋亡途徑表現(xiàn)出不同的表達(dá)量?？梢酝茰y氧化還原反應(yīng)很可能是移植后免疫抑制反應(yīng)中的關(guān)鍵因素。這些發(fā)現(xiàn)有助于闡明異種異體移植免疫抑制反應(yīng)的分子機(jī)制，也有益于珠母貝異種移植免疫抑制試劑的開發(fā)。

8.創(chuàng)新點(diǎn)

通過珍珠貝同種移植和異種移植差異表達(dá)基因的比較研究，尋找異種異體移植免疫抑制中的關(guān)鍵影響因素，開辟了珍珠貝異種異體移植研究的新方向。

 

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