07月03 “逆向思維”——良性病變組織NGS研究高分文章解析

習(xí)慣了正向思維不如來個反向思維；

???????????????????????????????????惡性癌組織研究多了不如研究下良性病變組織

文獻：Ye L, Zhou X, Huang F, et al. The genetic landscape of benign thyroid nodules revealed by whole exome and transcriptome sequencing[J]. Nature Communications, 2017, 8.

?研究背景：

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）：是最常見的甲狀腺癌，其發(fā)病率約占甲狀腺癌發(fā)病率的70-80%， 每10萬人中有5.7個人患有PTC，女性約為8.8人，男性約為2.7人，屬于低度惡性腫瘤，分化程度高，預(yù)后良好。甲狀腺癌發(fā)病的第一癥狀是在頸部的甲狀腺區(qū)出現(xiàn)結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)常為無痛性，甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)生率很高，這些結(jié)節(jié)中約有5%的結(jié)節(jié)可能會出現(xiàn)癌變。已經(jīng)有諸如TCGA等研究機構(gòu)對PTC的腫瘤相關(guān)變異進行了鑒定（BRAF和RAS基因突變等），但是對于良性結(jié)節(jié)的基因組特征所知甚少。良性增生性甲狀腺結(jié)節(jié)，尤其是腺瘤樣結(jié)節(jié)，尚未研究過。

新穎點/研究目的：1.甲狀腺癌組織研究的很多，良性結(jié)節(jié)的遺傳和表達景觀如何？

• 傳統(tǒng)認為PTC和良性結(jié)節(jié)具有獨立起源，是否可以提供基因組層面證據(jù)？
• 傳統(tǒng)的基因檢測技術(shù)通過檢測惡性癌組織相關(guān)突變標志提供納入標準（rule-in）輔助診斷，是否可以鑒定良性組織相關(guān)突變標志提供排除標準（rule-out）？

實驗材料：共計28例患者的經(jīng)過手術(shù)獲得的127個樣本的癌組織（PTC）或結(jié)節(jié)組織、正常組織及配對的germline外周血液樣本?；颊吒鶕?jù)有無PTC癌組織分成2組，TB和SB（只有良性結(jié)節(jié)，且持續(xù)2年）。

研究結(jié)果：

1.良性腺瘤樣甲狀腺結(jié)節(jié)相比于乳頭狀甲狀腺癌具有獨特的變異

外顯子組測序（平均161X）結(jié)果顯示，相比于外周血，在正常組織、良性結(jié)節(jié)組織和乳頭狀甲狀腺癌組織中共計檢測到了528個基因中的688個體細胞突變，腫瘤組織和結(jié)節(jié)組織中體細胞突變數(shù)目（/Mb）明顯高于正常組織，但腫瘤組織和結(jié)節(jié)組織的突變特征（6種類型的堿基替換及其上下文）卻明顯不同。

經(jīng)過高頻突變基因（significantly mutated genes,SMGs）分析，乳頭狀甲狀腺癌中以BRAF突變?yōu)橹鳎?0%樣本中攜帶），最主要的是BRAFV600E突變，這與TCGA的研究是一致的。而良性結(jié)節(jié)（TB和SB兩組）組織中與癌組織中完全不同，檢測到了互相排斥的ZNF148 (21.4%)、SPOP (14.3%) 和EZH1 (10.7%)。

 

高頻突變基因頻譜

 

在額外的231例良性結(jié)節(jié)中對上述三個基因中主要的體細胞突變進行了驗證，ZNF148基因突變頻率有所下降（5.4%），其他2個基因突變保持相似水平（SPOP P94R 11.2%，EZH1 Q571R 9.3%）。55例濾泡狀甲狀腺癌（follicular thyroid carcinomas，F(xiàn)TC）中未檢測到上述3個基因突變，表明特異存在于良性結(jié)節(jié)中。

SPOP，EZH1和ZNF148體細胞突變示意圖

利用人正常甲狀腺細胞系Nthy，構(gòu)建突變體進行功能實驗發(fā)現(xiàn)，EZH1 Q571R突變細胞系相比于野生型細胞系，細胞增殖能力輕微增加，侵襲能力降低。EZH1體細胞突變可能是甲狀腺腫的早期刺激因素之一。

細胞增殖和侵襲實驗

對外顯子數(shù)據(jù)進行CNV分析，只在癌組織中檢測到了已知的PTC相關(guān)的22號染色體長臂arm水平拷貝數(shù)缺失，而良性結(jié)節(jié)中沒有發(fā)現(xiàn)重現(xiàn)性的CNV。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析后，也沒有發(fā)現(xiàn)重現(xiàn)性或者功能性的基因融合。

TB組來自相同PTC患者配對的癌組織和良性結(jié)節(jié)間相同的突變很少

PTC癌組織-良性結(jié)節(jié)pairs間的共有突變頻率展示

PTC癌組織和良性結(jié)節(jié)的重疊突變頻率最低（0-21.4％，中位數(shù)7.7％）。 當(dāng)考慮匹配的正常組織時，只有9個PTC癌組織和良性結(jié)節(jié)對顯示重疊的突變（1.7-7.4％）。共有突變少與純度沒有顯著相關(guān)性。TB組20個PTC患者的配對組織間體細胞突變變異等位基因頻率（variant allele frequency,VAF）進行相關(guān)性分析，癌組織-良性結(jié)節(jié)間的相關(guān)性最差。

配對樣本間體細胞突變VAF相關(guān)性熱圖

良性結(jié)節(jié)與PTC癌組織間具有不同的基因表達模式

對9個患者（5個TB和4個SB）的26個組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，相比于正常甲狀腺組織共計檢測到21441個差異表達基因，只有8％的上調(diào)和3.1％的下調(diào)基因在PTC和良性結(jié)節(jié)之間重疊。

差異表達基因Venn圖

經(jīng)過層次聚類分析，惡性癌組織聚類在一起，和良性結(jié)節(jié)/正常組織分開，且TB和SB的良性結(jié)節(jié)組織聚類在一起，表明二者間相似的功能。

差異表達基因?qū)哟尉垲悷釄D

采用3種已知的甲狀腺分化和信號傳導(dǎo)特征分類器均發(fā)現(xiàn)良性結(jié)節(jié)和PTC癌組織明顯分離。3個分類器分別為：甲狀腺分化評分（TDS，16個與甲狀腺代謝和功能相關(guān)的基因）、ERK活性評分（EAS，用于MEK / ERK活性測定的52個基因）和BRAF-RAS突變特征相關(guān)的71個基因集。

甲狀腺分化評分TDS和ERK活性評分熱圖

良性結(jié)節(jié)和PTC癌組織獨立進化

對20名患者構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，以說明PTCs、良性結(jié)節(jié)和正常甲狀腺組織之間的進化關(guān)系。大多數(shù)患者（15/20例）在良性結(jié)節(jié)和PTC之間早期即處于不同分支進化，特別是在正常甲狀腺組織納入分析時，表明PTC癌組織與良性結(jié)節(jié)間早期分離和不同的進化模式。

基于突變的系統(tǒng)發(fā)育樹

研究結(jié)論

本研究提供強有力的證據(jù)表明良性甲狀腺結(jié)節(jié)具有與PTC癌組織不同的遺傳和轉(zhuǎn)錄組景觀，證實了良性結(jié)節(jié)發(fā)育與PTC腫瘤形成不同。 良性甲狀腺結(jié)節(jié)不同于癌前病變，例如存在復(fù)發(fā)性BRAF突變的黑素細胞痣或具有惡性轉(zhuǎn)化風(fēng)險的良性病變。作者認為，將SPOP，ZNF148和EZH1作為良性結(jié)節(jié)相關(guān)基因的納入，通過提供“排除”信息，有可能提高基于DNA的突變檢測的診斷效能。在目前的甲狀腺分子診斷中添加良性相關(guān)突變標志，從而提供“排除”信息，可能會增加其診斷功效。

 

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