07月19 【成功案例】通過轉(zhuǎn)錄組分析合浦珠母貝同種異體移植血細胞中免疫相關(guān)差異表達基因的鑒定

Differentially expressed immune-related genes in hemocytes of the pearl oyster Pinctada fucata against allograft identified by transcriptome analysis

雜志：Fish & Shell?sh Immunology

影響因子：3.148

PMID:?28126621

研究背景：合浦珠母貝是在中國普遍養(yǎng)殖的海洋珍珠貝，占海洋珍珠產(chǎn)業(yè)90%以上的比例。為了培養(yǎng)珍珠，需要將供體珍珠牡蠣的地幔片用細胞核移植到受體中，但是移植后的免疫抑制反應(yīng)會使成功率降低。加強了解宿主牡蠣對移植體的免疫反應(yīng)有利于提高珍珠培養(yǎng)技術(shù)的效率。然而，當(dāng)前的研究中關(guān)于珍珠貝對同種異體移植的免疫抑制報道卻很少。本文擬通過對移植的合浦珠母血細胞轉(zhuǎn)錄組動態(tài)變化進行研究，獲得移植反應(yīng)過程相關(guān)基因。

 

研究材料：?

生長1.5年的健康合浦珠母貝（P. fucata）

將和浦珠母貝進行同種地幔片移植手術(shù)，分別收集手術(shù)后0h和48h血淋巴，每個時期選取6-7只牡蠣的樣本進行混合，分別提取兩個樣本的total RNA。

 

研究方法：在本研究中，對同種異體移植后0小時和48小時的珍珠貝的血細胞免疫反應(yīng)進行了轉(zhuǎn)錄組分析。與合浦珠母貝的參考基因組進行了比對，為了鑒定所有與免疫相關(guān)的差異表達基因，本研究進行了GO注釋和KEGG通路分析。最后，隨機篩選免疫相關(guān)差異表達基因進行qRT-PCR驗證，以確保研究的準確性。

測序平臺：Illumina Hiseq 2500 platform

測序數(shù)據(jù)量：測序得到92.5M的clean reads

 

技術(shù)路線：

結(jié)果

結(jié)果

1.測序結(jié)果

兩個樣本Raw reads經(jīng)過去接頭和去低質(zhì)量的reads后分別得到6.1Gb（0h）和6.2Gb（48h）的數(shù)據(jù)量。且每個樣本的Q30值都大于92%，GC含量分別是44.73%（0h）和42.19%（48h），與合浦珠母貝參考基因組比對率分別是58.95%（0h）和60.27%（48h），如表1所示。

表1.轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2.基因注釋結(jié)果

與合浦珠母貝參考基因組比對，共獲得1912個新基因，通過與NR/Swiss-Prot/ GO/ COG和KEGG數(shù)據(jù)庫比對，其中1579個基因找到注釋信息，另外333個基因沒有在數(shù)據(jù)庫中找到注釋信息，如表2所示

表2.新基因注釋信息統(tǒng)計

3.兩組之間差異表達分析結(jié)果

比對0h和48h基因表達量，共獲得798個差異表達基因（其中410個上調(diào)基因，388個下調(diào)基因）。在這些差異表達基因中其中有226個與編碼熱休克蛋白家族的基因在0h高表達，其中314個與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶和EF-hand 鈣離子結(jié)合蛋白的相關(guān)基因在48h高表達，這些基因都與免疫防護有關(guān)。

圖1.0h/48h每個基因表達水平火上圖

4.差異表達基因功能注釋結(jié)果

為了進一步研究這些差異表達基因的生物學(xué)價值，對這798個差異表達基因按照功能進行GO富集分析，共產(chǎn)生45個GO terms。所有的基因都歸到cellular?component（17個terms），molecular function（11個terms）和biological processes（17個terms）三個功能類別，其中與免疫相關(guān)的差異表達基因主要富集在“biological process”一類，且這一類別中有9個差異表達基因富集在免疫系統(tǒng)過程子分類，有67個差異表達基因富集在刺激反應(yīng)子分類。

圖2.差異表達基因GO分類

5.免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達基因的鑒定結(jié)果

為了在這些差異表達基因中更進一步的挖掘免疫相關(guān)基因，研究人員將免疫反應(yīng)相關(guān)差異表達基因按照不同功能進行分類，獲得64個GO terms，其中包含51個差異表達基因，有刺激反應(yīng)（8個基因）、抗菌體液反應(yīng)（5個基因）、對壓力的響應(yīng)（8個基因）。其他的GO terms主要與這些子分類相關(guān)：受體介導(dǎo)的胞吞、真菌反應(yīng)、饑餓反應(yīng)以及損傷修復(fù)。鑒定了一些參與細胞凋亡和死亡的基因，包含金屬蛋白酶-19基質(zhì)、絲氨酸/蘇氨酸激酶、Kr-h1、酪氨酸蛋白激酶Abl、和ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白。另外，有24個差異表達基因?qū)儆诖碳?、壓力和溫性反?yīng)的GO類別。這些基因跟移植免疫反應(yīng)相關(guān)（其中6個上調(diào)，18個下調(diào)），包括TLR 和HSP。

研究人員將以上獲得的所有的差異表達基因比對到KEGG數(shù)據(jù)庫去尋找與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因。在798個差異表達基因中，有122個基因?qū)?yīng)到64個KEGG通路。其中，19個免疫相關(guān)基因?qū)?yīng)到16個通路，包括內(nèi)吞作用（5個）、NOD-like受體信號通路（1個）、泛素介導(dǎo)蛋白質(zhì)水解（4個）和其他路徑。研究人員主要關(guān)注抵御病原體入侵相關(guān)的toll-like受體信號通路和溶酶體。這一路徑有四個主要的基因家族，分別有TLRs、?IRFs、Ils和?TNFs。共鑒定了1個與TLR信號通路相關(guān)的unigene，2個與溶酶體相關(guān)的unigene 。

圖3.Unigene的KEGG通路分布圖

該研究通過基因注釋、聚類分析和通路分析的方法，最終鑒定了72個典型的免疫基因（其中25個上調(diào)基因，47個下調(diào)基因）。隨后，研究人員將這些免疫相關(guān)差異表達基因按照不同時期進行分層聚類分析，在0h和48h兩個時期的免疫相關(guān)差異表達基因有明顯不同，說明移植前后牡蠣中免疫相關(guān)變化明顯。

圖4.?分層聚類分析

6.qRT-PCR驗證

研究者隨機對其中18個免疫相關(guān)的差異表達基因進行qRT-PCR實驗。結(jié)果顯示用qRT-PCR檢測到的倍性變化與RNA-Seq的表達模式相比，結(jié)果基本一致，且RNA-Seq檢測更敏感。

圖4.qRT-PCR驗證

研究結(jié)論

該轉(zhuǎn)錄組研究共發(fā)現(xiàn)了1912個新基因，移植和非移植組比對后共有798個差異表達基因，通過GO富集和KEGG通路分析等方式最終鑒定出了72個典型的免疫相關(guān)基因，包括TLRs、細胞因子、HSPs、細胞凋亡和抗氧化劑等。另外，通過qRT-PCR對其中18個免疫相關(guān)的差異表達基因進行驗證，實驗結(jié)果與RNA-Seq的結(jié)果基本一致表明該實驗結(jié)果準確可信。

 

 

創(chuàng)新點

首次通過合浦珠母貝轉(zhuǎn)錄組測序研究尋找到與同種異體移植免疫相關(guān)的基因，為進一步分析合浦珠母貝同種異體移植的免疫抑制提供了依據(jù)，為同種異體移植牡蠣存活率的提高提供了有價值的信息。