10月26 【成功案例】油菜分枝角度轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
題目：mRNA-miRNA整合分析揭示BR、auxin信號通路參與調(diào)控油菜分蘗（分枝）角度
發(fā)表雜志：Int J Mol Sci ?影響因子：3.226
研究背景
油菜是全球范圍內(nèi)非常重要的一種油料作物，隨著人口的增加與可用耕地面積的減少，最大限度提高包括油菜在內(nèi)的各類作物的產(chǎn)量成為了育種學(xué)家考慮的一個重要問題。增大單位土地上的種植密度是一種增加作物產(chǎn)量的策略，每棵植物生長所需的地上面積主要由側(cè)枝的數(shù)量、長度與著枝角度決定，這些因素中，對側(cè)枝及葉子著枝角度的研究對于植物的高密度種植策略的應(yīng)用具有重要的意義。
在以往的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，水稻中的LAZY1,、TILLER ANGLE CONTROL1、PROSTRATE GROWTH1、 LOOSE PLANT ARCHITECTURE1基因，玉米中的ZmTAC1、ZmLAZY1基因，擬南芥中的 AtLAZY1 、 AtLPA1基因均參與調(diào)控了葉子或側(cè)枝的著枝角度。在代謝物水平，通常認(rèn)為葉或枝的著枝角度與植物生長素（ auxin）、油菜內(nèi)脂素（Brassinosteroids，BR）的在組織中的不均勻分布有關(guān)系。
在植物中，一些microRNA也被發(fā)現(xiàn)與auxin調(diào)控網(wǎng)絡(luò)或者分蘗角度相關(guān)，比如，miR393通過auxin調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響葉與根的形態(tài)結(jié)構(gòu)；miR164可降解轉(zhuǎn)錄因子NAC1轉(zhuǎn)錄本，從而下調(diào)植物對auxin的響應(yīng)水平，抑制植物側(cè)根的發(fā)育；auxin響應(yīng)基因ARF8、ARF6在大部分物種中被miRNA167調(diào)控；水稻中，過表達(dá)miR160，水稻分蘗角度增大。
目前，油菜中對分蘗角度的研究還比較少，本研究組之前基于F2群體，使用BSA混池性狀座位定位策略，鑒定到了一個與auxin合成相關(guān)，且可能參與了側(cè)枝著枝角度調(diào)控的基因BnaYUCCA6。
該研究通過對分枝角度有顯著差異的兩種油菜品系進(jìn)行mRNA與microRNA高通量測序，來進(jìn)一步探討油菜中與分蘗角度相關(guān)的分子調(diào)控機制。
材料與方法
材料：
油菜品系6098B（較大分枝角度，約52度）
油菜品系Purler（較小分支角度，約22度）
方法：
測序類型：mRNA、microRNA高通量測序
測序平臺：illumina Hiseq 2000測序平臺
取樣方法：兩個品系的均取抽薹時期與花發(fā)育早期兩個時間點的分枝發(fā)生部位。每個品系每個時期1個樣本（每個個體至少取5個分枝發(fā)生部位，最多6個個體混樣樣本），總共4個樣本，每個樣本分別進(jìn)行mRNA測序與microRNA測序
數(shù)據(jù)分析平臺：百邁云數(shù)據(jù)分析平臺（http://cigarsoftampa.com/）
Figure 1
技術(shù)路線
結(jié)果：mRNA測序與分析
a）每個樣本測序得到~6Gbase 可用數(shù)據(jù)，與參考基因組比對率~80%。
b）差異表達(dá)基因篩選（EBseq，F(xiàn)DR < 0.05 & |FC|>2)：如圖2A所示，抽薹期，兩個品系間檢測得到5908個差異表達(dá)基因；花發(fā)育早期，兩個品系間檢測到5397個差異表達(dá)基因。其中3261個為兩個時間點共有差異表達(dá)基因。
c）對上述3261個共有差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分析，如圖2B所示，差異基因在biological adhesion、biological phase、and locomotion、 macromolecular complex、cell junction、and nucleoid 、nuclear and protein binding transcription factor activity and receptor activity等GO term上有顯著富集。
d）對兩個時間點所有差異基因進(jìn)行KEGG通路分析，其中3297個基因注釋到了KEGG數(shù)據(jù)庫 ，其中大多數(shù)基因注釋到了 ribosome 、oxidative phosphorylation相關(guān)代謝通路。值得注意的是，在兩個時間點分別有58、51個差異基因注釋到了植物激素信號通路，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這些通路大多為BR或auxin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。該部分結(jié)果如圖3所示。
Figure 3
e）圖4展示了在BR生物合成、BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、auxin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上鑒定到的差異表達(dá)基因。這些差異基因中，BR6OX調(diào)控了BR生物合成過程中multiple C-6C的氧化過程；DWRF1催化24-methylenecholesterol轉(zhuǎn)化為campesterol，該過程為BR生物合成的第一步；分布在BR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的差異基因包括 BRI1, BSK, BZR1, and CYCD3等, 這些基因多在品系 Purler中下調(diào) (見圖 5E)；分布在 auxin 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的基因包括 AUX1, IAA, GH3, ARF等，其中 IAAs, GH3s, ?ARFs 在兩個時間點的 Purler品系材料中均表現(xiàn)為上調(diào)。
結(jié)果：miRNA測序與分析
a）每個樣本測序得到~7M ?可用reads，長度分布在18nt到30nt之間。
b） 鑒定得到202個 microRNAs, 包括 85 個miRbase注釋的已知microRNA， 111 具有穩(wěn)定發(fā)卡前體結(jié)構(gòu)的新型 microRNA。
c） IDEG6軟件分析（ |FC| >2)進(jìn)行差異表達(dá)分析，兩個時間點在兩個品系間分別檢測得到45、65個差異表達(dá)microRNA。值得注意的是，如圖7所示，除了miR1140 與miR827, 抽薹時間點上的所有已知 差異表達(dá)miRNAs 均在 品系Purler中上調(diào)，這其中包括3個miR156 家族 與6個 miR395 家族microRNA，相反，花發(fā)育早期時間點上的所有差異表達(dá)miRNAs 均在 品系Purler中下調(diào)。
e）為了分析差異表達(dá)microRNA的生物學(xué)功能，使用TargetFinder軟件對所有差異表達(dá)microRNA進(jìn)行了靶基因預(yù)測，得到的一些靶基因參與了分枝角度調(diào)控，比如， ?miRX215的兩個靶基因與擬南芥中 ?organellar (peroxisome, glyoxysome) 3-ketoacyl-CoA thiolase編碼基因同源； miRX115.1 的3個靶基因與擬南芥中 ATP-dependent caseinolytic (Clp) protease編碼基因同源。
結(jié)果：miRNA-mRNA聯(lián)合分析
大部分的miRNA與其對應(yīng)的靶基因在表達(dá)量上均呈負(fù)相關(guān)，比如， miR156 在Purler品系中轉(zhuǎn)錄上調(diào), 其對應(yīng)的大部分的 靶向 SPL 基因在Purler品系中表現(xiàn)為下調(diào)； ?miR395 與miR319 在Purler品系中轉(zhuǎn)錄上調(diào) ，其對應(yīng)的靶基因包括 Sulfate Transporter (SULT) 、TEOSINTE-BRANCHED/CYCLOIDEA/PCF (TCP)表現(xiàn)為相反的趨勢，這些結(jié)果說明，本研究中的mRNA-seq、microRNA-seq結(jié)果均比較可靠。轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)為相反趨勢的的miRNA-gene 可用于后期進(jìn)一步更加深入的挖掘油菜分枝背后的microRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
結(jié)論
鑒定得到了一些分布在BR、auxin生物合成或者是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上的差異表達(dá)基因與microRNA，這些基因或者microRNA可作為與油菜分枝角度調(diào)控相關(guān)的潛在基因集，為后續(xù)更加深入的相關(guān)分子學(xué)機制研究提供了數(shù)據(jù)支持。