11月16 豬植入前胚胎發(fā)育過程中基因間長鏈非編碼RNA的鑒定和功能分析
PMID:?27922056
雜志：Scientific?reports
影響因子：5.228
研究背景：隨著高通量RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)在許多物種中鑒定出了大量的基因間長鏈非編碼RNA（lincRNAs）。有研究表明，一些lincRNA在植入前胚胎發(fā)育（PED）過程中發(fā)揮重要作用。豬是一種理想的生殖和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究模型，然而對豬lincRNAs的研究還比較欠缺，因此需要對lincRNAs進(jìn)行全面的全基因組范圍鑒定。此外，合子基因組激活（ZGA）對成功的移植前胚胎發(fā)育至關(guān)重要，因此需要對ZGA的具體分子機(jī)制進(jìn)行研究。目前很少有研究報(bào)道豬PED中轉(zhuǎn)錄組的變化情況，對PED中l(wèi)incRNAs的功能研究還很有限。
公共數(shù)據(jù)獲取：
從NCBI-SRA數(shù)據(jù)庫中下載得到五個(gè)豬RNA-Seq數(shù)據(jù)集，Supplementary?Table?S1中列出了RNA-seq數(shù)據(jù)編號和詳細(xì)信息。
Supplementary?Table?S1?Details?of?RNA-seq?data
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技術(shù)路線：
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實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1.基于豬RNA-seq數(shù)據(jù)集的lincRNAs鑒定
本文利用5個(gè)包含豬各種組織或細(xì)胞的RNA-seq數(shù)據(jù)（Supplementary?Table?S1）對linckRNAs進(jìn)行了全面鑒定。經(jīng)reads?mapping和轉(zhuǎn)錄本組裝后從122,007個(gè)基因座鑒定出了195,531個(gè)轉(zhuǎn)錄本。排除已知mRNA并進(jìn)一步篩選后獲得了7,618個(gè)lincRNA。
2.豬lincRNA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
作者對預(yù)測獲得的lincRNAs和Ensemble中記錄的mRNAs進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)lincRNAs中的外顯子明顯較少(平均值：lincRNAs?2.97個(gè)、mRNAs?8.49?個(gè);?Kolomogorv-Smirnov?Test,?P-value<2.2×10?16)（Fig.?2A）。而豬lincRNAs外顯子長度比蛋白編碼基因長(平均值：lincRNAs?484bp、mRNAs?307bp；?Kolomogorv-
Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)（Fig.?2B）。由于較少的外顯子數(shù)量，整體lincRNA長度小于蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本長度(平均值：lincRNAs?1338?bp、mRNAs?2842?bp；Kolomogorv-Smirnov?Test，P-value<2.2×10?16)?(Fig.?2C)。
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Figure?2.?Features?of?pig?lincRNAs.
? ? ? ? 3.豬lincRNAs的低表達(dá)量和組織特異性
? ? ? ? 對不同組織和細(xì)胞系中l(wèi)incRNAs的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示lincRNAs與蛋白編碼基因相比表達(dá)量較低。為了定量評估每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特異性，作者應(yīng)用依賴于Jensen-Shannon（JS）距離算法的基于熵度量法計(jì)算每個(gè)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特異性。結(jié)果顯示，lincRNAs比蛋白編碼基因表現(xiàn)出更高的JS平均值（Fig.?3B），這說明lincRNAs比蛋白編碼基因有更高的組織特異性。
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Figure?3.?Characteristics?of?pig?lincRNAs?expression.
? ? ? ? 4.lincRNAs與鄰近蛋白質(zhì)編碼基因之間潛在的順式作用關(guān)系
? ? ? ? 研究表明，lincRNAs可能通過正、負(fù)兩種方式調(diào)節(jié)鄰近蛋白編碼基因表達(dá)。通過GO分析發(fā)現(xiàn)豬lincRNAs的鄰近蛋白編碼基因被富集到“轉(zhuǎn)錄調(diào)控”功能。對lincRNA與鄰近蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs）距離的分析發(fā)現(xiàn)了462個(gè)TSSs距離在4kb以內(nèi)的lincRNA:mRNA對。值得注意的是lincRNA:mRNA對中32%的lincRNAs始于400nt內(nèi)，而mRNA:mRNA對只有12%（Fig.?3D）。這些結(jié)果說明豬的lincRNAs可以順式調(diào)節(jié)他們鄰近蛋白編碼基因的表達(dá)。
5.植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs的功能分析
過濾除去每個(gè)胚胎發(fā)育階段的低方差lincRNAs和mRNAs后,進(jìn)行了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）探索豬PED過程中l(wèi)incRNA的作用。通過無監(jiān)督聚類分析鑒定出了23個(gè)共表達(dá)模塊（Fig.?4A）。其中5個(gè)模塊顯示發(fā)育階段特異性（Fig.?4B），它們可能代表每一個(gè)過渡階段的核心基因網(wǎng)絡(luò)。為了進(jìn)一步預(yù)測lincRNAs在豬PED過程中發(fā)揮的功能，作者對每個(gè)階段特異性模塊進(jìn)行了GO富集分析，發(fā)現(xiàn)對應(yīng)ZGA的4細(xì)胞到8細(xì)胞轉(zhuǎn)變階段的模塊被富集到轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀調(diào)控和細(xì)胞周期條目中（Fig.?4C）。
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Figure?4.?Function?prediction?of?PED?associated?lincRNAs.
? ? ? ? 6.豬植入前胚胎發(fā)育樞紐?linckRNA的鑒定
? ? ? ? 為了鑒定豬PED中的樞紐linckRNA，作者利用WGCNA測量了模塊內(nèi)的基因間連接，并提取了每個(gè)階段特異性模塊中的前100個(gè)樞紐基因。然后在4細(xì)胞階段特異性模塊中的樞紐基因集中選取10個(gè)lincRNAs進(jìn)行了qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs在生殖組織中作為一個(gè)整體表達(dá)（Fig.?5A）。研究還發(fā)現(xiàn)在卵巢中高表達(dá)的兩個(gè)lincRNAs：tcons_00166370和tcons_00020255?在4細(xì)胞階段顯示出明顯的激活趨勢，而8細(xì)胞階段迅速下調(diào)（Fig.?5B）。盡管這些參與豬PED過程的lincRNAs的作用機(jī)制還不清楚，樞紐lincRNAs的鑒定為進(jìn)一步的功能研究提供了寶貴的資源。
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Figure?5.?The?expression?of?two?hub?lincRNAs?from?4-cell?stage-specific?module?in?different?tissues?and?PED.
結(jié)論：進(jìn)行了完整的豬lincRNAs分析，提供了首個(gè)豬植入前胚胎發(fā)育相關(guān)lincRNAs圖譜。WGCNA分析顯示PED相關(guān)lincRNAs與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄和表觀調(diào)控過程有關(guān)。對樞紐lincRNAs的qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)與PED密切相關(guān)的lincRNA：TCONS_00166370?和TCONS_00020255。