12月27 外源細(xì)胞分裂素和脫落酸響應(yīng)的荔枝果皮轉(zhuǎn)錄組分析

發(fā)表雜志：Plant Growth Regulation

影響因子：2.646

摘要

荔枝（Litchi chinensis?Sonn.）是一種重要的水果作物，起源于中國(guó)，并在世界熱帶和亞熱帶地區(qū)商業(yè)化種植。荔枝紅色果皮的顏色是荔枝果實(shí)市場(chǎng)接受度的重要品質(zhì)，果皮的粉紅色/紅色是花青素生物合成和積累的結(jié)果，花青素-3-葡萄糖苷和花青素-3-蕓香糖苷是荔枝紅果皮中的主要花青素。荔枝花青素的數(shù)量和組成在不同的品種間差異很大，也很大程度上受各種環(huán)境因素的影響。因此，深入了解荔枝中花青素生物合成的調(diào)控具有重要的科學(xué)意義和經(jīng)濟(jì)意義。

許多研究表明，花青素生物合成很大程度上受植物激素的影響。外源脫落酸（ABA）處理促進(jìn)荔枝花青素生物合成，而外源性N-（2-氯吡啶-4-基）-N’-苯基脲（CPPU）抑制荔枝花青素生物合成。但是，ABA或CPPU調(diào)控花青素生物合成的機(jī)制仍不清楚。為了進(jìn)一步了解外源ABA和CPPU調(diào)控荔枝果實(shí)花青素生物合成的分子基礎(chǔ)，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院趙杰堂老師課題組對(duì)ABA或CPPU處理的荔枝果皮進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并進(jìn)行了全面的分析。

材料和方法

選取生長(zhǎng)十五年的L. chinensis?cv，妃子笑。 三種處理方式：ABA處理，CPPU處理和對(duì)照處理（自來(lái)水），每組處理約15個(gè)果實(shí)簇。處理后分別取0,10和20天果皮圓盤，共取7組樣本分別是：Cont-0，Cont-10，Cont-20，ABA-10，ABA-20，CPPU-10，CPPU-20，分別提取總RNA，用于RNA測(cè)序。

測(cè)序平臺(tái)：北京百邁客生物科技有限公司Illumina Hiseq平臺(tái)?150PE

分析平臺(tái)：百邁客云平臺(tái)（BMKCloud）

分析內(nèi)容：1.原始數(shù)據(jù)質(zhì)控；2.參考基因組比對(duì)（未發(fā)表）；3.差異表達(dá)基因分析（韋恩圖繪制，KEGG富集分析）；4.基因功能注釋（使用Blast2Go 基于Nr，Nt，COG，KO，GO數(shù)據(jù)庫(kù)的最高相似性進(jìn)行基因注釋）；5.統(tǒng)計(jì)分析

花青素和葉綠素含量的測(cè)定以及內(nèi)源ABA分析

研究人員根據(jù)Wrolstad（1982）等人的描述進(jìn)行相應(yīng)的修改對(duì)果皮中總花青素含量進(jìn)行定量，根據(jù)Arnon（1949）描述的方法計(jì)算總?cè)~綠素含量，根據(jù)Jia（2011）等人所述，進(jìn)行了一些修改，使用氣相色譜 – 質(zhì)譜（GC-MS）測(cè)定ABA含量，每個(gè)過(guò)程重復(fù)三次。

結(jié)果

1.經(jīng)外源ABA和CPPU處理后，荔枝果皮的表型、色素含量和內(nèi)源ABA水平的變化

處理10天后，ABA處理和對(duì)照處理的果實(shí)開始著色（圖1a），盡管花青素含量沒(méi)有顯著差異（圖1b）。然而，CPPU處理的果實(shí)只有一點(diǎn)點(diǎn)紅色（圖1a），并且花青素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于ABA處理和對(duì)照的果實(shí)（圖1b）。處理后20天，ABA處理的果實(shí)變成均勻的紅色，并且CPPU處理的果實(shí)仍然是綠色的，帶有一點(diǎn)紅色（圖1a）。同時(shí)，對(duì)照果實(shí)呈現(xiàn)不均勻的紅色（圖1a），這是cv妃子笑的典型特征。如圖1b所示，ABA處理20天后明顯促進(jìn)荔枝果皮花青素積累，而CPPU處理顯著抑制荔枝果皮花青素積累。與花青素含量變化相反，果實(shí)成熟過(guò)程中葉綠素含量降低。顯然，ABA處理加速葉綠素降解和CPPU處理延緩了這一過(guò)程（圖1c）。ABA處理的果實(shí)與對(duì)照之間的內(nèi)源ABA水平?jīng)]有顯著差異，而CPPU處理的果相比而言具有較低的ABA水平（圖1d）。

圖1.各處理組果皮顏色、花青素、葉綠素及ABA含量變化

2.RNA測(cè)序以及參考基因組比對(duì)

共構(gòu)建7個(gè)文庫(kù)，測(cè)序過(guò)濾后每個(gè)樣本數(shù)據(jù)均不低于6.6Gb，平均GC含量為45.36％（表1）。與荔枝參考基因組比對(duì)（未發(fā)表），比對(duì)率是74.7％（表1）。

表1. RNA-Seq結(jié)果展示

3.外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮基因表達(dá)譜的綜合分析

三種處理后0天，10天和20天的荔枝果皮中發(fā)現(xiàn)了許多差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（圖2）。荔枝果皮色素沉著過(guò)程中，在對(duì)照組鑒定了2263個(gè)差異表達(dá)基因（DEGs）（圖2a）。除此之外， 經(jīng)過(guò)ABA（圖2b）和CPPU（圖2c）處理后的三個(gè)階段分別鑒定了1986和2862個(gè)DEGs。

圖2.三組處理中差異表達(dá)基因韋恩圖

為了鑒定ABA和CPPU調(diào)控的花青素生物合成的DEGs，分別選擇ABA / CPPU處理后10天和20天的DEGs與對(duì)照組進(jìn)行比較。 與對(duì)照相比，在ABA和CPPU處理的果皮中分別有579和827個(gè)DEGs。 表達(dá)模式分析表明，在ABA處理10天和20天后，上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量均比下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量多。而 CPPU處理后20天上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量比ABA處理的低很多。

4.外源ABA處理后的荔枝果皮表達(dá)分析

外源ABA處理組，對(duì)顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行GO分析，發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞過(guò)程，代謝過(guò)程，細(xì)胞，細(xì)胞部分，催化活性和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性有關(guān)的GO terms的富集。也做了DEGs的KEGG通路富集分析。 579個(gè)DEGs中的351個(gè)被富集到101個(gè)通路中，前5個(gè)通路組分別為：植物 – 病原體相互作用通路（49DEGs），植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（32DEGs），類黃酮生物合成（27DEGs），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工（27DEGs） 碳代謝（20 DEGs），淀粉和蔗糖代謝（20 DEGs）。

外源ABA處理的DEGs中，大部分與花青素合成有關(guān)的DEGs上調(diào)，如PAL，C4H，CHS，CHI，DFR，LDOX和GTs。此外， FLS和LAR等黃酮醇和原花青素合成基因上調(diào)， C3’H，COMT，F(xiàn)5H，CCR，CAD等木質(zhì)素合成基因也上調(diào)了。 ABA處理后另一類顯著差異表達(dá)的unigene參與植物激素代謝和信號(hào)傳導(dǎo)。兩個(gè)編碼ABA生物合成途徑中的關(guān)鍵酶的NCEDs unigenes顯著上調(diào)，而ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在外源ABA處理后沒(méi)有明顯的變化。外源ABA處理也影響了與生長(zhǎng)素信號(hào)途徑有關(guān)的基因表達(dá)。例如，屬于Aux / IAAs家族的兩個(gè)unigenes上調(diào)。另外，編碼DELLA蛋白，負(fù)調(diào)控GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的unigenes經(jīng)ABA處理后上調(diào)。

5.外源CPPU處理的荔枝果皮表達(dá)分析

將CPPU處理組與對(duì)照組之間的DEG進(jìn)行GO分析。 與外源ABA處理相比，差異不顯著。KEGG富集分析， 897個(gè)DEGs中的493DEGs個(gè)被富集到117個(gè)通路，前六個(gè)通路組是碳代謝（54DEGs），植物 – 病原體相互作用（49DEGs），光合作用（42DEGs），氨基酸生物合成（38DEGs），苯丙素生物合成 （33DEGs），植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（32DEGs）。

與ABA處理不同的是，外源CPPU處理后許多上調(diào)基因參與碳代謝，氨基酸生物合成和光合作用的基因，特別是在CPPU處理后10天較明顯。例如，unigene Litchi__GLEAN_10019646在外源CPPU處理10天后顯著上調(diào)6.1倍，它編碼捕光復(fù)合體II葉綠素a / b結(jié)合蛋白1。另外一類在外源性CPPU處理中顯著差異表達(dá)的unigenes涉及葉綠素生物合成代謝。 CPPU處理后，大部分參與類黃酮和花青素生物合成的DEGs均下調(diào)，如PAL，C4H，CHS和LDOX。此外，黃酮醇和原花青素合成基因，如FLS和LAR也下調(diào)。有29個(gè)DEGs比對(duì)到植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。其中，ABA信號(hào)中的兩個(gè)ABA受體PYR / PYL均被CPPU下調(diào)。另外，與生長(zhǎng)素，GA和乙烯信號(hào)有關(guān)的基因大部分也下調(diào)。

6.ABA和CPPU處理的荔枝果皮的表達(dá)分析

受外源ABA和CPPU共同響應(yīng)的DEGs共199個(gè)，其中大部分unigenes在兩種處理組中顯示出類似的改變。 值得注意的是，有10個(gè)unigenes在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出相反的模式。 其中，編碼GST4蛋白的unigene（Litchi_GLEAN_10051861）被報(bào)道與荔枝中花青素的液泡轉(zhuǎn)移有關(guān)。

ABA處理和CPPU處理之間的顯著差異之一是葉綠素代謝。 鑒定了與葉綠素生物合成和降解有關(guān)的24個(gè)候選基因，其響應(yīng)外源ABA和CPPU的表達(dá)模式如圖3所示?？傮w而言，ABA處理對(duì)葉綠素生物合成和降解的基因表達(dá)沒(méi)有顯著影響。 與對(duì)照相比，CPPU處理顯著提高大多數(shù)葉綠素合成基因，并下調(diào)TF SGR。

圖3.兩種處理后荔枝果皮中葉綠素生物合成和降解相關(guān)差異表達(dá)基因熱圖

 

經(jīng)外源ABA處理和CPPU處理的一些涉及類黃酮生物合成途徑的unigenes的表達(dá)有不同的改變（圖4）。 該研究鑒定了不止一個(gè)荔枝黃酮類生物合成的結(jié)構(gòu)基因，并且不同的基因家族成員表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。 根據(jù)研究人員以前的研究，選擇黃酮生物合成相關(guān)基因作進(jìn)一步分析。 如圖4所示，ABA處理上調(diào)荔枝黃酮合成的結(jié)構(gòu)基因，而CPPU抑制其表達(dá)，特別是PAL，CHS和F3’H。

圖4.兩種處理后荔枝果皮中黃酮類生物合成途徑相關(guān)差異表達(dá)基因概覽

7.qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)9個(gè)顯著差異表達(dá)的基因進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，分別是：HEMA，CBR，DFR，CHI，UFG，chloaophyllase，RCCR和SGR。 結(jié)果顯示，RT-PCR結(jié)果與RNA-seq數(shù)據(jù)一致（圖5）。

圖5. qRT-PCR分析結(jié)果圖

結(jié)論

在褪色階段外源ABA處理提高了荔枝的顏色，而外源CPPU處理抑制了花青素的積累。 RNA-seq分析結(jié)果顯示：兩種處理組（ABA和CPPU）與對(duì)照相比，分別有579個(gè)和827個(gè)差異表達(dá)基因。外源ABA處理中，上調(diào)表達(dá)的有類黃酮和花青素合成相關(guān)基因。相反，外源CPPU處理中，誘導(dǎo)了與碳代謝，氨基酸生物合成和光合作用有關(guān)的基因，并下調(diào)了花青素生物合成相關(guān)基因。結(jié)果表明，ABA處理對(duì)花青素生物合成和糖代謝中涉及的基因的表達(dá)有顯著作用。 另外，ABA處理對(duì)葉綠素分解代謝相關(guān)基因無(wú)顯著影，CPPU處理顯著增加了葉綠素合成基因的表達(dá)，并抑制了葉綠素降解基因（SGR）的表達(dá)，說(shuō)明外源CPPU處理通過(guò)增加葉綠素合成基因的表達(dá)和抑制葉綠素降解基因的表達(dá)來(lái)影響葉綠素分解代謝。進(jìn)一步分析顯示，ABA和CPPU處理也影響其他植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑（如生長(zhǎng)素，GA和乙烯）中的基因表達(dá)，說(shuō)明ABA和CPPU可能與其他激素信號(hào)途徑如生長(zhǎng)素，GA和乙烯相互作用，形成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控花青素的生物合成。

 

創(chuàng)新點(diǎn)

研究人員在前期的研究中為此項(xiàng)研究做了較好的鋪墊，然而，早期的研究?jī)H關(guān)注于外源ABA和CPPU對(duì)荔枝果皮單基因或少量基因的表達(dá)。本研究采用轉(zhuǎn)錄組分析方法，了解外源ABA和CPPU處理后荔枝果皮的整體分子變化。本研究為ABA和細(xì)胞分裂素影響荔枝和其他富含花青素的果樹中花青素生物合成的機(jī)制探索提供了有價(jià)值的信息。

 

參考文獻(xiàn)：Hu, B., Li, J., Wang, D. et al. Plant Growth Regul (2017). https://doi.org/10.1007/s10725-017-0351-7